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電泳分離的主要影響因素

更新時間:2015-06-16點擊次數(shù):1412

1. 電場強度:電場強度(V/cm)是每厘米的電位降,也稱電位梯度。電場強度越大,電泳速度越快。但增大電場強度會引起通過介質(zhì)的電流強度增大,而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增大。電流在介質(zhì)中所做的功(W)為:W=I2.R.t式中:I為電流強度,R為電阻,t為電泳時間。  電流所作的功絕大部分都轉換為熱,因而引起介質(zhì)溫度升高,這會造成很多影響:1樣品和緩沖離子擴散速度增加,引起樣品分離帶的加寬;2產(chǎn)生對流,引起待分離物的混合;3如果樣品對熱敏感,會引起蛋白變性;4引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向外周散發(fā)的,所以介質(zhì)中心溫度一般要高于外周,尤其是管狀電泳,由此引起中央部分介質(zhì)相對于外周部分粘度下降,摩擦系數(shù)減小,電泳遷移速度增大,由于中央部分的電泳速度比邊緣快,所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度,可以減小生熱,但會延長電泳時間,引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當?shù)碾妶鰪姸龋瑫r可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。

2. 待分離生物大分子的性質(zhì):待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會對電泳有明顯影響。一般來說,子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形,則其電泳遷移速度越快。

3. 緩沖液的性質(zhì):緩沖液的pH值會影響待分離生物大分子的解離程度,從而對其帶電性質(zhì)產(chǎn)生影響,溶液pH值距離其等電點愈遠,其所帶凈電荷量就越大,電泳的速度也就越大,尤其對于蛋白質(zhì)等兩性分子,緩沖液pH還會影響到其電泳方向,當緩沖液pH大于蛋白質(zhì)分子的等電點,蛋白質(zhì)分子帶負電荷,其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩(wěn)定性,緩沖液通常要保持一定的離子強度,一般在0.020.2,離子強度過低,則緩沖能力差,但如果離子強度過高,會在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層(即離子氛),由于離子氛與待分離分子的移動方向相反,它們之間產(chǎn)生了靜電引力,因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會對電泳速度產(chǎn)生影響。

4. 電滲:液體在電場中,對于固體支持介質(zhì)的相對移動,稱為電滲現(xiàn)象。由于支持介質(zhì)表面可能會存在一些帶電基團,如濾紙表面通常有一些羧基,瓊脂可能會含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基團等等。這些基團電離后會使支持介質(zhì)表面帶電,吸附一些帶相反電荷的離子,在電場的作用下向電極方向移動,形成介質(zhì)表面溶液的流動,這種現(xiàn)象就是電滲。在pH值高于3時,玻璃表面帶負電,吸附溶液中的正電離子,引起玻璃表面附近溶液層帶正電,在電場的作用下,向負極遷移,帶動電極液產(chǎn)生向負極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同,則加快電泳速度;如果相反,則降低電泳速度。

5. 支持介質(zhì)的篩孔:支持介質(zhì)的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快,反之,則泳動速度慢。


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